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Der Differentialinterferenzkontrast, kurz DIC, macht feine Strukturen in transparenten und ungefärbten Präparaten sichtbar. Dafür wird das Licht in zwei eng benachbarte Teilstrahlen aufgeteilt, durch das Präparat geleitet und anschließend wieder zusammengeführt.
Unterschiede in der optischen Weglänge erscheinen dadurch als helle und dunkle Bereiche. Das Ergebnis ist ein kontrastreiches Bild, das fast dreidimensional wirkt, obwohl es keine echte räumliche Aufnahme darstellt.
Auf einen Blick
- DIC macht transparente und ungefärbte Strukturen besser sichtbar.
- Das Verfahren arbeitet mit polarisiertem Licht und speziellen Prismen.
- Zwei leicht versetzte Lichtstrahlen durchlaufen benachbarte Bereiche des Präparats.
- Unterschiede der optischen Weglänge werden in Helligkeitsunterschiede umgewandelt.
- Das typische Reliefbild wirkt räumlich, zeigt aber nicht direkt die tatsächliche Oberflächenhöhe.
- DIC benötigt aufeinander abgestimmte optische Komponenten und eine sorgfältige Einstellung.
Der Differentialinterferenzkontrast ist ein lichtmikroskopisches Kontrastverfahren für überwiegend transparente Präparate. Zwei eng benachbarte, unterschiedlich polarisierte Lichtstrahlen durchlaufen das Objekt, werden wieder vereinigt und interferieren miteinander. Unterschiede der optischen Weglänge erscheinen dadurch als helle und dunkle Strukturen mit einem charakteristischen reliefartigen Eindruck.
Was ist der Differentialinterferenzkontrast?
Viele biologische Präparate bestehen größtenteils aus Wasser und nahezu durchsichtigen Zellbestandteilen. Sie absorbieren nur wenig Licht und erzeugen deshalb im normalen Hellfeld kaum Helligkeitsunterschiede. Zellmembranen, Zellkerne oder feine Organellen können vorhanden sein, ohne sich deutlich vom Hintergrund abzuheben.
Der Differentialinterferenzkontrast nutzt nicht in erster Linie die Lichtabsorption. Stattdessen reagiert er auf Unterschiede in der optischen Weglänge.
Diese optische Weglänge hängt vereinfacht von zwei Faktoren ab:
- von der geometrischen Dicke einer Struktur,
- vom Brechungsindex des Materials.
Der Brechungsindex beschreibt, wie stark Licht in einem Stoff abgebremst und gebrochen wird. Zwei gleich dicke Bereiche können daher unterschiedliche optische Weglängen besitzen, wenn sie aus verschiedenen Materialien bestehen. Umgekehrt kann dasselbe Material unterschiedliche Werte erzeugen, wenn seine Dicke variiert.
DIC macht vor allem die Änderungen dieser optischen Weglänge sichtbar. Gleichmäßige Flächen bleiben häufig relativ unauffällig, während Übergänge und feine Strukturgrenzen deutlich hervortreten.
Der Differentialinterferenzkontrast wird auch als differentieller Interferenzkontrast, Nomarski-Kontrast oder im Deutschen als DIK bezeichnet. International hat sich jedoch die englische Abkürzung DIC für „Differential Interference Contrast“ durchgesetzt.
Warum transparente Präparate im Hellfeld kaum zu erkennen sind
Beim klassischen Hellfeld entsteht der Kontrast hauptsächlich dadurch, dass Bestandteile des Präparats Licht absorbieren, streuen oder unterschiedlich stark durchlassen. Ein gefärbter Gewebeschnitt funktioniert deshalb im Hellfeld sehr gut.
Bei einer lebenden, ungefärbten Zelle sieht es anders aus. Viele Zellbestandteile lassen nahezu gleich viel Licht hindurch wie ihre Umgebung. Im Okular erscheint dann möglicherweise nur ein schwacher Umriss.
Eine Färbung könnte den Kontrast erhöhen. Sie verändert oder tötet jedoch je nach Verfahren das Präparat und ist für die längere Beobachtung lebender Vorgänge häufig ungeeignet.
DIC setzt an einem anderen Punkt an. Das Verfahren erkennt, dass Licht in verschiedenen Bereichen des Präparats unterschiedlich stark verzögert wird. Diese zunächst unsichtbaren Phasenunterschiede werden in sichtbare Helligkeitsunterschiede umgewandelt.
Wie das klassische Verfahren arbeitet und warum ungefärbte Präparate dort häufig kontrastarm bleiben, erkläre ich ausführlich in meinem Beitrag zur Hellfeldmikroskopie.
Wie funktioniert DIC?
Das Grundprinzip klingt zunächst kompliziert. Es lässt sich aber gut verstehen, wenn Du den Lichtweg Schritt für Schritt verfolgst.
1. Ein Polarisator richtet das Licht aus
Das Licht einer normalen Mikroskopbeleuchtung schwingt in unterschiedlichen Richtungen. Ein Polarisator lässt nur Licht mit einer festgelegten Schwingungsrichtung passieren.
Du kannst Dir den Polarisator wie ein sehr feines Gitter vorstellen. Nur Lichtwellen mit der passenden Ausrichtung gelangen hindurch.
DIC arbeitet deshalb ausschließlich mit polarisiertem Licht. Das unterscheidet das Verfahren unter anderem vom normalen Hellfeld und vom klassischen Phasenkontrast.
2. Ein Prisma teilt das Licht in zwei Strahlen
Nach dem Polarisator trifft das Licht auf ein spezielles doppelbrechendes Prisma. Je nach System handelt es sich beispielsweise um ein Nomarski-Prisma, ein Wollaston-Prisma oder eine abgewandelte Bauform.
Das Prisma teilt das Licht in zwei Teilstrahlen auf. Diese besitzen senkrecht zueinander stehende Polarisationsrichtungen und liegen nur einen sehr kleinen Abstand auseinander.
Die Strahlen laufen also nicht durch exakt denselben Punkt des Präparats. Sie durchqueren zwei unmittelbar benachbarte Bereiche. Dieser geringe seitliche Versatz wird als Scherung oder „Shear“ bezeichnet.
3. Beide Teilstrahlen durchlaufen das Präparat
Durchlaufen die beiden Strahlen Bereiche mit gleicher optischer Weglänge, werden sie nahezu gleich beeinflusst. Treffen sie dagegen auf unterschiedliche Strukturen, entsteht zwischen ihnen ein Phasenunterschied.
Ein Strahl könnte beispielsweise durch das Zellinnere laufen, während der zweite knapp außerhalb der Zelle durch das umgebende Wasser verläuft. Beide Wege sind geometrisch fast gleich lang. Wegen der unterschiedlichen Brechungsindizes werden die Lichtwellen jedoch unterschiedlich verzögert.
Als Vergleich kannst Du Dir zwei Wanderer vorstellen, die auf parallelen Wegen unterwegs sind. Einer läuft über glatten Asphalt, der andere über weichen Sand. Obwohl beide dieselbe Strecke zurücklegen, erreichen sie das Ziel nicht zur gleichen Zeit.
4. Ein zweites Prisma vereinigt die Strahlen
Hinter dem Objektiv befindet sich ein weiteres, zum System passendes DIC-Prisma. Es führt die zuvor getrennten Strahlen wieder zusammen.
Die Teilstrahlen besitzen nun möglicherweise einen kleinen Phasenunterschied. Ihre Wellenberge und Wellentäler treffen daher nicht überall passend aufeinander.
Je nach Phasenlage verstärken oder schwächen sich die Wellen gegenseitig. Diesen Vorgang nennt man Interferenz.
5. Der Analysator macht die Unterschiede sichtbar
Die beiden Strahlen sind weiterhin unterschiedlich polarisiert und könnten deshalb zunächst nicht in der gewünschten Weise miteinander interferieren. Ein zweiter Polarisationsfilter, der sogenannte Analysator, bringt passende Schwingungsanteile auf eine gemeinsame Ebene.
Aus den Phasenunterschieden entstehen dadurch Helligkeitsunterschiede. Manche Bereiche erscheinen heller, andere dunkler als der Hintergrund.
Eine ausführliche englischsprachige Darstellung des DIC-Lichtwegs mit ergänzenden Grafiken findest Du im DIC-Grundlagenartikel von Nikon MicroscopyU.
Warum sehen DIC-Bilder dreidimensional aus?
Ein typisches DIC-Bild sieht aus, als würde das Präparat schräg von der Seite beleuchtet. Eine Seite einer Struktur erscheint hell, die gegenüberliegende Seite dunkel.
Das Gehirn deutet solche Licht- und Schattenverläufe automatisch als Erhebungen und Vertiefungen. Deshalb wirken Zellen, Algen oder Einzeller im Differentialinterferenzkontrast häufig plastisch.
Dieser Eindruck ist jedoch ein Pseudo-Relief. Das Bild ist keine echte dreidimensionale Aufnahme und darf nicht wie eine topografische Karte gelesen werden.
Die Helligkeit zeigt nicht direkt die Höhe einer Struktur. Sie hängt unter anderem davon ab,
- wie sich die optische Weglänge verändert,
- in welcher Richtung diese Veränderung verläuft,
- wie das Präparat zur Scherrichtung der Prismen ausgerichtet ist,
- welche Kontrastvorspannung am DIC-System eingestellt wurde.
Drehst Du das Präparat auf dem Objekttisch, können bestimmte Details stärker oder schwächer hervortreten. In einer ungünstigen Richtung verlaufende Strukturen sind unter Umständen kaum sichtbar.
Das Relief kann sogar umgekehrt erscheinen. Eine vermeintliche Erhebung wirkt dann wie eine Vertiefung. Für eine sichere Interpretation solltest Du deshalb nie allein vom Schattenverlauf auf die tatsächliche Form schließen.
Was bedeutet „differentiell“ bei DIC?
Der Begriff „differentiell“ beschreibt, dass DIC nicht einfach die optische Weglänge an einem einzelnen Punkt darstellt. Das Verfahren vergleicht zwei sehr dicht nebeneinanderliegende Bereiche.
Sichtbar wird vor allem die Differenz zwischen diesen Bereichen. Mathematisch ähnelt das Ergebnis einer räumlichen Ableitung: Starke Änderungen werden betont, gleichbleibende Bereiche dagegen weniger.
Das erklärt zwei typische Eigenschaften:
- Kanten und feine Übergänge erscheinen besonders deutlich.
- Große, vollkommen gleichmäßige Flächen können ähnlich hell wie der Hintergrund bleiben.
DIC ist damit gewissermaßen ein optisches Verfahren zur Hervorhebung von Gradienten. Diese Hervorhebung findet bereits während der Bildentstehung statt und ist nicht einfach ein nachträglich angewendeter digitaler Filter.
Welche Bauteile benötigt ein DIC-Mikroskop?
Für echten Differentialinterferenzkontrast reichen zwei einfache Polarisationsfilter nicht aus. Das Mikroskop benötigt mehrere genau aufeinander abgestimmte Komponenten.
Polarisator
Der Polarisator befindet sich im Beleuchtungsstrahlengang, meistens unterhalb des Kondensors. Er erzeugt linear polarisiertes Licht.
Kondensorprisma
Im oder in der Nähe des Kondensors sitzt das erste DIC-Prisma. Es teilt das Licht in zwei unterschiedlich polarisierte Teilstrahlen auf.
Viele DIC-Kondensoren besitzen mehrere umschaltbare Prismen. Diese sind für bestimmte Objektive oder Vergrößerungsbereiche vorgesehen.
DIC-Schieber oder Objektivprisma
Das zweite Prisma befindet sich hinter dem Objektiv oder in einem dafür vorgesehenen Schieber am Objektivrevolver. Es muss zum verwendeten Objektiv und zum Kondensorprisma passen.
Mit einem Einstellmechanismus lässt sich bei vielen Systemen die sogenannte Bias-Verzögerung verändern. Damit werden Hintergrundhelligkeit, Kontrast und Schattenwirkung beeinflusst.
Analysator
Der Analysator sitzt oberhalb des zweiten Prismas. Seine Polarisationsrichtung ist gegenüber dem Polarisator gekreuzt.
Geeignete Objektive und Kondensoren
Nicht jedes Objektiv eignet sich automatisch für DIC. Spannungen im Glas, Verkittungen und andere optische Eigenschaften können polarisiertes Licht unerwünscht verändern.
Hersteller verwenden deshalb passende, möglichst spannungsarme Objektive und exakt berechnete Prismenkombinationen. Auch Kondensor, Objektiv, Prismen und Mikroskopstativ müssen optisch zusammenpassen.
Warum Objektiv, Kondensor und Aperturblende aufeinander abgestimmt sein müssen, zeige ich ausführlicher im Beitrag zur numerischen Apertur.
Kann ein normales Mikroskop mit DIC nachgerüstet werden?
Eine Nachrüstung ist grundsätzlich nur möglich, wenn das Mikroskopsystem dafür vorbereitet ist und passende Komponenten erhältlich sind.
Benötigt werden unter anderem:
- Aufnahmen für Polarisator und Analysator,
- ein geeigneter DIC-Kondensor oder passende Kondensorprismen,
- ein Platz für das objektivseitige Prisma,
- kompatible Objektive,
- exakt zueinander passende Prismen.
Einzelne Bauteile verschiedener Mikroskopserien lassen sich normalerweise nicht beliebig kombinieren. Selbst äußerlich ähnliche Prismen können unterschiedliche Scherungen, Ausrichtungen und Korrekturen besitzen.
Ein zufällig zusammengestelltes System kann zwar manchmal einen reliefartigen Effekt erzeugen. Gleichmäßige Ausleuchtung, neutraler Hintergrund und optimale Auflösung sind dann aber nicht gewährleistet.
Aus diesem Grund ist DIC meist ein komplettes optisches System und kein universeller Filter, den Du einfach in jedes Mikroskop einsetzt.
Differentialinterferenzkontrast richtig einstellen
Die genaue Bedienung hängt vom Mikroskop und vom Hersteller ab. Die folgende Vorgehensweise zeigt daher nur das allgemeine Prinzip. Bei einem konkreten Gerät solltest Du zusätzlich die Anleitung des Systems beachten.
1. Zuerst das Hellfeld sauber einstellen
Bevor Du die DIC-Komponenten einschwenkst, stellst Du das Präparat zunächst im normalen Hellfeld scharf. Anschließend richtest Du die Köhlersche Beleuchtung ein.
Dabei werden Leuchtfeldblende, Kondensorhöhe und Kondensorzentrierung korrekt eingestellt. Eine saubere Köhler-Beleuchtung ist eine wichtige Voraussetzung für eine gleichmäßige DIC-Darstellung.
Bevor Du die DIC-Komponenten einschaltest, solltest Du zunächst die Köhlersche Beleuchtung richtig einstellen.
2. Passendes Kondensorprisma auswählen
Wähle am DIC-Kondensor die Position, die zum verwendeten Objektiv gehört. Einige Systeme verwenden ein Prisma für mehrere Objektive, andere besitzen getrennte Positionen.
Die Beschriftung kann beispielsweise auf die Vergrößerung oder einen bestimmten Objektivbereich hinweisen. Entscheidend sind die Vorgaben des Herstellers und nicht allein die aufgedruckte Vergrößerungszahl.
3. Objektivseitiges Prisma einsetzen
Schiebe das passende DIC-Prisma vollständig in den Strahlengang. Bei manchen Mikroskopen befindet es sich in einem einzelnen Schieber, bei anderen in einem drehbaren Revolver oder Zwischenstück.
4. Polarisator und Analysator einschalten
Bringe Polarisator und Analysator in den Strahlengang. In der Ausgangsstellung sind beide normalerweise gekreuzt.
Ohne wirksame DIC-Prismen sollte das Bild bei gekreuzten Polarisatoren weitgehend dunkel werden. Eine starke Aufhellung kann auf eine falsche Stellung, spannungsreiche optische Bauteile oder ein ungeeignetes Präparatgefäß hindeuten.
5. Präparat scharfstellen
Fokussiere einen interessanten Bereich des transparenten Präparats. Feine Grenzen sollten nun bereits deutlich hervortreten.
6. Bias oder Prismenschieber einstellen
Verändere den DIC-Schieber langsam. Der Hintergrund wechselt dabei von dunkel über grau bis hell. Je nach System können außerdem Interferenzfarben auftreten.
Für eine natürliche Schwarz-Weiß-Darstellung ist ein neutraler grauer Hintergrund häufig ein guter Ausgangspunkt. Drehe die Einstellung anschließend vorsichtig weiter, bis die interessierenden Strukturen deutlich, aber nicht übertrieben erscheinen.
7. Aperturblende prüfen
Eine sehr stark geschlossene Aperturblende erhöht zwar scheinbar den Kontrast, reduziert aber Auflösung und Lichtmenge. DIC kann normalerweise mit einer relativ weit geöffneten Apertur arbeiten.
Die optimale Stellung hängt vom Präparat und vom Objektiv ab. Statt die Blende grundsätzlich weit zu schließen, solltest Du zwischen Kontrast, Auflösung und Schärfentiefe abwägen.
8. Präparat bei Bedarf drehen
Manche Strukturen verlaufen ungünstig zur Scherrichtung und bleiben dadurch kontrastarm. Drehe den Objektträger probeweise um etwa 90 Grad und vergleiche das Bild.
Eine Struktur, die zuvor kaum sichtbar war, kann in der neuen Ausrichtung deutlich hervortreten.
Welche Präparate eignen sich für DIC?
Der Differentialinterferenzkontrast eignet sich besonders für transparente Phasenobjekte, die im Hellfeld nur wenig Eigenkontrast besitzen.
Typische Beispiele sind:
- lebende Zellen auf einem geeigneten Glasboden,
- Einzeller aus einer Wasserprobe,
- Algen und feine Pflanzenteile,
- dünne ungefärbte Gewebeschnitte,
- Zellkulturen,
- Hefezellen,
- kleine Wasserorganismen,
- feine Fasern und transparente Materialstrukturen.
Besonders eindrucksvoll ist DIC bei Präparaten, die viele feine Übergänge des Brechungsindex oder der Dicke enthalten. Zellgrenzen, Vakuolen, Zellkerne und innere Strukturen können dadurch plastisch hervortreten.
Einfache Wasser- und Pflanzenproben kannst Du mit meiner Anleitung selbst vorbereiten: Präparate für das Mikroskop herstellen.
Weitere Beispiele für DIC-Aufnahmen transparenter und ungefärbter biologischer Präparate zeigt Leica Microsystems in seinem Grundlagenbeitrag.
Welche Präparate bereiten Probleme?
DIC verwendet polarisiertes Licht. Materialien, die dessen Polarisationszustand selbst verändern, können deshalb störende Effekte verursachen.
Doppelbrechende Präparate
Kristalle, Stärkekörner, bestimmte Fasern und andere doppelbrechende Materialien können intensive Helligkeits- oder Farbeffekte erzeugen. Diese überlagern möglicherweise den eigentlichen DIC-Kontrast.
Solche Präparate sind nicht grundsätzlich uninteressant. Ihre Darstellung lässt sich aber schwieriger eindeutig als reiner DIC-Effekt interpretieren.
Kunststoffgefäße
Kunststoffe können durch Spannungen aus der Herstellung doppelbrechend wirken. Besonders problematisch sind dicke Böden herkömmlicher Zellkulturschalen.
Sie verändern oder depolarisieren das Licht und führen zu ungleichmäßigen Hintergründen, Farben oder schwachem Kontrast. Für DIC werden daher häufig Glasgefäße oder Kulturschalen mit dünnem Glasboden verwendet.
Sehr dicke Präparate
DIC kann zwar auch in etwas dickeren Präparaten eine gewisse optische Tiefentrennung ermöglichen. Bei stark streuenden oder sehr dicken Objekten überlagern sich jedoch viele Strukturen entlang des Lichtwegs.
Das Bild wird dann unruhig und schwer interpretierbar. DIC ersetzt keine echte optische Schnitttechnik wie die konfokale Mikroskopie.
Die Vorteile des Differentialinterferenzkontrasts
Ungefärbte Präparate werden sichtbar
DIC macht viele transparente Strukturen sichtbar, ohne dass Du das Präparat vorher färben musst. Das ist besonders interessant, wenn natürliche Bewegungen oder lebende Zellen beobachtet werden sollen.
Hohe Detailauflösung
Im Gegensatz zum klassischen Phasenkontrast benötigt DIC keinen Phasenring im Objektiv. Die Objektivapertur lässt sich deshalb gut ausnutzen.
Feine Einzelheiten erscheinen klar und scharf. Besonders Kanten und kleine Veränderungen der optischen Weglänge werden hervorgehoben.
Weniger ausgeprägte Halos
Im Phasenkontrast entstehen an starken Übergängen häufig helle oder dunkle Säume. Diese werden als Halos bezeichnet.
DIC erzeugt diese typischen ringförmigen Säume nicht in derselben Form. Stattdessen entsteht der charakteristische Hell-Dunkel-Verlauf entlang der Scherrichtung.
Plastischer Bildeindruck
Die reliefartige Wirkung erleichtert es oft, feine Grenzen und innere Strukturen voneinander zu unterscheiden. Das Bild wirkt anschaulich und eignet sich gut für die visuelle Dokumentation.
Begrenzte optische Tiefentrennung
Bei Objektiven mit hoher numerischer Apertur besitzt DIC eine geringe Schärfentiefe. Durch vorsichtiges Verstellen des Feintriebs lassen sich nacheinander unterschiedliche Ebenen eines Präparats betrachten.
Dabei handelt es sich jedoch nicht um eine vollständige dreidimensionale Rekonstruktion.
Die Grenzen und Nachteile von DIC
Aufwendige und exakt abgestimmte Optik
DIC benötigt mehrere präzise gefertigte Bauteile. Prismen, Objektive und Kondensor müssen zusammenpassen. Das macht das System technisch aufwendiger als Hellfeld, Dunkelfeld oder viele Phasenkontrastsysteme.
Richtungsabhängiger Kontrast
Strukturen werden abhängig von ihrer Ausrichtung unterschiedlich stark dargestellt. Eine einzelne Aufnahme kann deshalb Details übersehen, die quer zur günstigen Scherrichtung verlaufen.
Kein echtes Höhenbild
Der räumliche Eindruck ist leicht misszuverstehen. Helle und dunkle Seiten einer Struktur beweisen nicht, dass dort tatsächlich eine Erhebung oder Vertiefung vorliegt.
Im Durchlicht beeinflussen sowohl die Dicke als auch der Brechungsindex die optische Weglänge. Beides lässt sich in einem normalen DIC-Bild nicht ohne Weiteres voneinander trennen.
Probleme mit doppelbrechenden Materialien
Spannungen in Kunststoff, bestimmte Kristalle und ungeeignete optische Bauteile können die Polarisation verändern. Dadurch entstehen störende Aufhellungen und Farben.
Sorgfältige Einstellung notwendig
Ein falsch zentrierter Kondensor, ein unpassendes Prisma oder eine ungeeignete Aperturstellung kann die Bildqualität deutlich verschlechtern.
DIC belohnt eine saubere Einstellung, verzeiht aber weniger Ungenauigkeiten als das einfache Hellfeld.
DIC, Phasenkontrast, Hellfeld und Dunkelfeld im Vergleich
| Verfahren | Entstehung des Kontrasts | Typischer Bildeindruck | Besonders geeignet für | Typische Grenze |
|---|---|---|---|---|
| Hellfeld | Absorption und Streuung | Heller Hintergrund, dunklere Strukturen | Gefärbte oder deutlich absorbierende Präparate | Transparente Objekte bleiben kontrastarm |
| Dunkelfeld | Seitlich gestreutes Licht | Helle Strukturen vor dunklem Hintergrund | Feine Partikel, Kanten und dünne Organismen | Innere Flächenstrukturen oft schwerer erkennbar |
| Phasenkontrast | Umwandlung von Phasenunterschieden durch Phasenring | Graues Bild mit typischen Säumen | Dünne lebende Zellen und sehr transparente Objekte | Halos und begrenzte Eignung für dickere Präparate |
| DIC | Interferenz zweier seitlich versetzter Teilstrahlen | Scharfes, reliefartiges Bild | Transparente Präparate mit feinen optischen Übergängen | Richtungsabhängig und technisch aufwendig |
DIC oder Phasenkontrast?
Phasenkontrast und DIC verfolgen ein ähnliches Ziel: Beide machen transparente Phasenobjekte sichtbar, ohne dass diese stark gefärbt werden müssen.
Phasenkontrast ist häufig unkomplizierter und eignet sich besonders gut für sehr dünne Zellen. Kleine, schwach kontrastierende Objekte können damit deutlich hervortreten.
DIC liefert meist ein schärfer wirkendes Bild ohne die typischen Phasenkontrast-Halos. Dafür benötigt es polarisiertes Licht und reagiert empfindlich auf doppelbrechende Gefäße und Präparate.
Wie das andere wichtige Verfahren für transparente und ungefärbte Präparate funktioniert, erkläre ich im Beitrag zur Phasenkontrastmikroskopie.
DIC oder Dunkelfeld?
Im Dunkelfeld siehst Du hauptsächlich Licht, das vom Präparat gestreut oder gebeugt wird. Kleine Teilchen und feine Umrisse leuchten dadurch vor einem schwarzen Hintergrund.
DIC besitzt einen hellen oder grauen Hintergrund und stellt Änderungen der optischen Weglänge als Schattenverläufe dar. Dadurch werden häufig auch innere Strukturen besser erkennbar.
Für feine Partikel, Fasern und stark streuende Strukturen kann dagegen die Dunkelfeldmikroskopie besonders interessant sein.
Durchlicht-DIC und Auflicht-DIC
Der Differentialinterferenzkontrast lässt sich sowohl im Durchlicht als auch im Auflicht verwenden. Die technischen Anordnungen und Einsatzgebiete unterscheiden sich jedoch.
DIC im Durchlicht
Beim Durchlicht-DIC passiert das Licht das Präparat. Dieses Verfahren wird vor allem für transparente biologische und technische Proben verwendet.
Der Kontrast hängt von Änderungen der optischen Weglänge ab. Diese können sowohl durch unterschiedliche Dicken als auch durch unterschiedliche Brechungsindizes entstehen.
Beim Durchlichtmikroskop durchquert das Licht das transparente Präparat. Beim Auflichtmikroskop wird das Licht dagegen an einer undurchsichtigen Oberfläche reflektiert.
DIC im Auflicht
Beim Auflicht-DIC wird das Licht an einer undurchsichtigen Oberfläche reflektiert. Das Objektiv übernimmt dabei gleichzeitig Aufgaben der Beleuchtung und Abbildung.
Auflicht-DIC wird beispielsweise zur Untersuchung polierter Metalle, Halbleiteroberflächen, Wafer und anderer feiner technischer Oberflächen eingesetzt. Kleine Unebenheiten oder Materialgrenzen erscheinen reliefartig.
Auch hier handelt es sich nicht automatisch um eine quantitative Höhenmessung. Reale Oberflächenformen tragen zwar zum Kontrast bei, Reflexionseigenschaften und Phasenänderungen können das Bild aber ebenfalls beeinflussen.
DIC-Bilder fotografieren
Der Differentialinterferenzkontrast eignet sich gut für die Mikrofotografie. Die plastische Darstellung wirkt auf Bildern meist sehr anschaulich.
Einige Punkte solltest Du trotzdem beachten.
Belichtung nicht zu knapp wählen
Ein zu dunkler Hintergrund kann Bereiche des Bildes vollständig schwarz erscheinen lassen. Dabei gehen feine Abstufungen verloren.
Stelle die Bias-Regelung besser so ein, dass noch Zeichnung in hellen und dunklen Bereichen vorhanden ist. Die Kamera sollte weder Lichter ausfressen noch Schatten vollständig verschlucken.
Weißabgleich kontrollieren
Bei neutral eingestelltem DIC erscheint das Bild überwiegend grau. Je nach Lichtquelle, Kamera und Bias-Stellung können jedoch blaue, gelbe oder andere Farbtöne entstehen.
Diese Farben sind keine natürlichen Farben des Präparats. Es handelt sich um optische Interferenzfarben beziehungsweise um Eigenschaften der Beleuchtung und Kameraeinstellung.
Mehrere Ausrichtungen aufnehmen
Da der Kontrast richtungsabhängig ist, kann es sinnvoll sein, das Präparat zu drehen und mehrere Aufnahmen zu erstellen.
So dokumentierst Du Strukturen, die in einer einzigen Orientierung möglicherweise kaum sichtbar sind.
Allgemeine Hinweise zu Kameraadaption, Beleuchtung und Bildschärfe findest Du im Ratgeber Fotografieren mit dem Mikroskop.
Häufige Fehler beim Differentialinterferenzkontrast
Unpassendes Kondensorprisma ausgewählt
Wird ein Prisma verwendet, das nicht zum Objektiv passt, können ungleichmäßige Helligkeit, schwacher Kontrast oder störende Farben entstehen.
Prüfe deshalb immer die Zuordnung des Herstellers.
Köhlersche Beleuchtung nicht eingestellt
Ein falsch positionierter oder dezentrierter Kondensor verursacht eine ungleichmäßige Ausleuchtung. Außerdem wird das Zusammenspiel der beiden Prismen gestört.
Richte daher zuerst das Hellfeld korrekt ein und schalte anschließend auf DIC um.
Aperturblende zu weit geschlossen
Eine stark geschlossene Blende erzeugt scheinbar mehr Kontrast. Gleichzeitig sinken Auflösung und Bildhelligkeit.
Versuche zunächst, den Kontrast über die Bias-Einstellung zu optimieren.
Normale Kunststoffschale verwendet
Spannungen im Kunststoff verändern polarisiertes Licht. Das Bild zeigt dann möglicherweise große farbige Flächen oder ungleichmäßige Helligkeit.
Eine Glasschale, ein Glasboden oder ein normaler Objektträger ist meist geeigneter.
Das Relief als echte Oberfläche interpretiert
Die räumliche Wirkung ist optisch erzeugt. Aus einer einzelnen DIC-Aufnahme kannst Du normalerweise keine sichere Aussage über die tatsächliche Höhe einer Struktur ableiten.
Kontrast zu stark eingestellt
Ein sehr heller oder sehr dunkler Hintergrund wirkt zunächst eindrucksvoll. Feine Abstufungen können dabei jedoch verloren gehen.
Ein mittlerer grauer Hintergrund liefert häufig mehr nutzbare Bildinformationen.
Ist eine schräge Beleuchtung bereits DIC?
Eine schräge Beleuchtung kann ebenfalls einen reliefartigen Bildeindruck erzeugen. Auch digitale Filter und spezielle Blenden können Bilder produzieren, die optisch an DIC erinnern.
Echter Differentialinterferenzkontrast entsteht jedoch nur, wenn polarisiertes Licht in zwei eng benachbarte Teilstrahlen aufgeteilt, durch das Präparat geführt und anschließend zur Interferenz gebracht wird.
Ein ähnlicher Schatteneffekt allein macht ein Bild deshalb noch nicht zu einer DIC-Aufnahme. Das ist besonders wichtig, wenn Aufnahmen verglichen oder wissenschaftlich dokumentiert werden. Diese Abgrenzung ergibt sich unmittelbar aus dem optischen Funktionsprinzip des Verfahrens.
Lohnt sich DIC für Hobby-Mikroskopiker?
DIC liefert beeindruckende Bilder und kann transparente Wasserorganismen, Algen oder Zellstrukturen sehr deutlich darstellen. Für den Einstieg in die Mikroskopie ist das Verfahren aber nicht zwingend notwendig.
Hellfeld, Dunkelfeld und Phasenkontrast decken bereits viele typische Anwendungen ab. Sie lassen sich häufig einfacher einrichten und stellen geringere Anforderungen an aufeinander abgestimmte Bauteile.
Interessant wird DIC vor allem, wenn Du
- regelmäßig transparente und ungefärbte Präparate untersuchst,
- Wert auf eine hohe Detailauflösung legst,
- ein kompatibles Mikroskopsystem besitzt,
- Freude an der präzisen Einstellung optischer Systeme hast,
- hochwertige Mikrofotos anfertigen möchtest.
Ich würde DIC deshalb nicht als allgemeine Voraussetzung für gute Mikroskopie betrachten. Es ist vielmehr ein spezialisiertes Kontrastverfahren, das bei passenden Präparaten seine besonderen Stärken zeigt.
Häufige Fragen zum Differentialinterferenzkontrast
Sind DIC und DIK dasselbe?
Ja. DIC ist die internationale Abkürzung für „Differential Interference Contrast“. Im Deutschen wird manchmal DIK für „differentieller Interferenzkontrast“ verwendet.
Beide Bezeichnungen meinen in der Regel dasselbe optische Kontrastverfahren. Auch der Begriff Nomarski-Kontrast ist gebräuchlich.
Kann man mit DIC die Höhe einer Struktur messen?
Mit einem normalen DIC-Mikroskop lässt sich die Höhe einer Struktur nicht direkt aus der Helligkeit oder dem Schattenverlauf ablesen.
Dicke, Brechungsindex, Ausrichtung, Scherrichtung und Bias-Einstellung beeinflussen gemeinsam das Bild. Es gibt quantitative und rechnergestützte Weiterentwicklungen, die zusätzliche Messungen ermöglichen. Eine gewöhnliche DIC-Aufnahme ist jedoch in erster Linie qualitativ.
Benötigt ein DIC-Präparat ein Deckglas?
Bei klassischen Durchlichtpräparaten wird normalerweise ein Deckglas verwendet. Objektive, Kondensor und Prismen sind meist für eine bestimmte Deckglasdicke und optische Anordnung berechnet.
Abweichungen können vor allem bei Objektiven mit hoher numerischer Apertur die Bildqualität verschlechtern. Für Zellkulturen eignen sich spezielle Gefäße mit dünnem Glasboden.
Wie Objektträger, Deckglas und Probendicke die Bildqualität beeinflussen, erkläre ich im Beitrag über Objektträger, Deckglas und Schnitttechnik.
Fazit: DIC macht unsichtbare Phasenunterschiede sichtbar
Der Differentialinterferenzkontrast verwandelt winzige Unterschiede der optischen Weglänge in sichtbare Helligkeitsverläufe. Dadurch erscheinen transparente und ungefärbte Präparate kontrastreich, scharf und beinahe dreidimensional.
Hinter diesem eindrucksvollen Bild steckt ein präzise abgestimmtes System aus Polarisatoren, Kondensor- und Objektivprismen. Das Verfahren ist aufwendiger als Hellfeld oder Phasenkontrast, bietet bei geeigneten Präparaten aber eine außergewöhnlich klare Darstellung feiner Strukturen.
Welche Präparate würdest Du gern einmal im Differentialinterferenzkontrast betrachten, oder hast Du bereits eigene Erfahrungen mit DIC gesammelt?
